| 作者： | 贺淼 |
| 专业： | 劳动卫生与环境卫生学 |
| 导师： | 孙贵范 |
| 授予学位： | 博士 |
| 授予学位单位： | 中国医科大学 |
| 关键词： | 大气污染颗粒物;卵蛋白;哮喘;细胞因子;趋化性细胞因子;Toll样受体;NALP3炎症复合体 |
| 摘要： | 大气污染是影响公众健康的首要环境危险因素之一。大气污染物是由诸多污染物组成的复杂混合物,目前公认的各种大气污染物中,可吸入颗粒物(particulatematter,PM)与人群健康效应各终点的流行病学联系最为密切,是定量评价大气污染健康危害的标志性污染物。本研究中使用电子加热器采集于我国北京空气中的城市空气颗粒物(urban particulate matte,IJPM)和采集于日本壹歧岛空气中的亚洲沙尘暴浮尘颗粒物(air-borne Asian sand dust,AASD)的部分样本进行加热处理,以去除吸附于其表面的微生物、SO42-和NO3-等成分。本实验中应用OVA致敏小鼠,采用气管灌注的方法,分别将加热处理的UPM(heated UPM,H-UPM)、未加热处理的UPM、加热处理的AASD(heated AASD,H-AASD)和未加热处理的AASD的悬浮液注入小鼠体内,观察小鼠肺组织病理形态学变化,支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavage fluid,BALF)中炎症细胞的分布变化,BALF中细胞因子和趋化性细胞因子的蛋白表达改变,以及血清中OVA特异性IgE和IgG1抗体的表达变化。体外培养小鼠巨噬细胞系(RAW264-7)观察TLRs和NALP3炎症复合体的基因表达变化,从而探求北京城市空气颗粒物和亚洲沙尘暴浮尘对机体健康危害的机制。本研究是关于北京城市空气颗粒物和亚洲沙尘暴浮尘对于OVA诱导哮喘小鼠气道炎症作用的首次实验研究。 实验方法 1、样本处理 分别将采集到的UPM和AASD样本在电子加热器中经过360℃加热处理30min,以除去吸附于颗粒物表面的微生物、SO42-和NO3-等成分。 2、真菌检测 应用荧光显微镜和真菌菌相Y荧光染料检测UPM和AASD样本中的真菌。参照真菌菌相Y荧光染料的实验说明书,将2.5 μg的样本悬浮于40 μl荧光染料中,经过5 min后制作成玻璃切片,于荧光显微镜下观察。激发波长为472.5 nm,发射波长为520.0 nm。 3、水溶性成份、脂多糖及β-葡聚糖的检测 应用离子色谱和电感耦合等离子体.原子发射光谱分析UPM和AASD样本中的水溶性成份如SO42-和NO3-等。应用Endospec ES test MK检测UPM和AASD样本中的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)含量,应用Fungitec G test MK检测UPM和AASD样本中的β-葡聚糖含量。 4、实验动物及染毒 从Charles River公司(神奈川,日本)购入雄性ICR小鼠,适应性喂养一周后开始实验。每间隔一周,将小鼠在4％三氟溴氯乙烷作用下麻醉,经气管注入颗粒物(0.1 ml/mouse)和/或OVA(0.1 ml/mouse)。最后一次染毒的第二天,经小鼠腹腔注射戊巴比妥,将其深度麻醉,放血处死。 5、实验动物的病理检测 剖取小鼠肺部固定于10％中性福尔马林缓冲液中,肺叶分离后,将其切割成2 mm大小的碎块,用石蜡包埋,制作成3 μm厚的切片。HE染色后观察呼吸道由近端向远端嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润情况。PAS染色后观察支气管上皮杯状细胞的增殖情况。应用显微镜对每个切片的炎症细胞和上皮细胞进行观察分析。 6、采集支气管肺泡灌洗液和血液 小鼠深度麻醉,心脏采血,离心后取上清液,-80℃β的深度冰箱中保存,用于检测血清中的OVA特异性抗体IgE和IgG1的表达；气管固定,用无菌生理盐水灌洗小鼠肺部,收集灌洗液后离心取上清液,-80℃的深度冰箱中保存,用于检测BALF中细胞因子和趋化性细胞因子的蛋白表达。 7、支气管肺泡灌洗液中的细胞计数 将支气管肺泡灌洗液离心后得到的沉淀溶于生理盐水中,制成细胞悬液,显微镜下应用血细胞计数器直接计数总细胞数。细胞悬液应用细胞离心涂片机,应用Diff-Quik染色,显微镜下观察计数嗜酸性粒细胞等炎性细胞。 8、肺泡灌洗液中的细胞因子和趋化性细胞因子的检测 应用酶联免疫反应检测BALF中细胞因子和趋化性细胞因子的蛋白表达。其中细胞因子包括:白细胞介素(Interleukin,IL)-4、IL-5、IL-12、IL-13和干扰素(interferon,IFN)-γ；趋化性细胞因子包括:角质细胞趋化因子(Keratinocyte chemoattractant,KC)、巨噬细胞炎症蛋白(macrophage inflammatory protein,MIP)-1α、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein,MCP)-1、MCP-3、调节激活正常T细胞表达和分泌细胞因子(regulated on activation normal T cell expressed and presumablysecreted,RANTES)和嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)。 9、OVA特异性IgE和IgG1抗体的检测 应用鼠OVA-IgE ELISA试剂盒和鼠OVA-IgG1 ELISA试剂盒检测血清中的OVA特异性IgE和IgG1抗体。 10、细胞培养及染毒 本研究中采用由BALB/c雄性小鼠中提取的巨噬细胞系RAW264.7。将加热、未加热的UPM和AASD样本分别配置成DMEM悬浮液,使其浓度均为3 mg/ml,观察细胞生长状态良好。每个培养皿中加入40 μl的UPM或AASD悬浮液,使其终浓度为30 μg/ml,在含5％CO2的37℃培养箱中,培养3 h后提取RNA。 11、RT-PCR ISOGEN提取RNA后,冰上操作反转录获得cDNA,进行RT-PCR分析TLRs和NALP3炎症复合体的基因表达。 12、统计学分析 本研究应用SPSS13.0统计学软件进行分析,统计结果表述为平均数±标准差,采用单因素方差分析比较不同染毒组的实验数据；当组间差异具有统计学意义时,采用SNK法进行组间比较,p<0.05具有统计学意义。 实验结果 1、附着于颗粒物表面的真菌检测 在未加热的UPM和AASD表面明显呈现荧光,该现象表明未经过加热处理的颗粒物表面吸附了真菌微生物。 2、颗粒物中化学成分、水溶性成分、脂多糖和β-葡聚糖的含量 UPM中的主要化学成分为二氧化硅(约占32％)和碳(约占12％)。AASD中的主要化学成分为二氧化硅(约占60％)。UPM和AASD均含有一定量的8042-、NO3-、Cl-、NH4+、LPS和β-葡聚糖；而经过加热处理的UPM和AASD中上述水溶性成分、LPS和β-葡聚糖的含量均未检测到。 3、颗粒物致小鼠肺部病理学改变的观察 OVA+UPM和OVA+AASD联合处理组的小鼠肺支气管上皮中杯状细胞显著增殖,在PAS反应中呈现粉色,呼吸道周围结缔组织中有明显的嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润,其病理学改变分别强于OVA+H-UPM和OVA+H-AASD联合处理组。 4、颗粒物对小鼠支气管肺泡灌洗液中炎症细胞分布的影响 OVA+UPM和OVA+AASD联合处理组小鼠的支气管肺泡灌洗液中的中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞以及淋巴细胞数量显著高于其他各处理组。 5、颗粒物对小鼠支气管肺泡灌洗液中细胞因子和趋化性细胞因子表达的影响 与OVA单独处理组相比,OVA+UPM和OVA+AASD联合处理组小鼠的支气管肺泡灌洗液中细胞因子IL-4、IL-5、IL-12和趋化性细胞因子MCP-1、MCP-3、嗜酸性粒细胞趋化因子的蛋白表达显著增加。 6、颗粒物对小鼠血清中OVA特异性IgE和IgG1表达的影响 与OVA单独处理组相比,OVA+UPM和OVA+AASD联合处理组小鼠的血清中OVA特异性IgE和IgG1抗体的表达明显增加。 7、颗粒物对鼠巨噬细胞中TLR2和TLR4 mRNA表达的影响 与对照组相比,AASD使小鼠巨噬细胞叶中TLR2表达mRNA显著增加,而TLR4表达mRNA显著减少,H-AASD处理组的mRNA表达无显著变化。 8、亚洲沙尘暴浮尘颗粒物对小鼠巨噬细胞中NALP3炎症复合体mRNA表达的影响 与对照组相比,AASD使小鼠巨噬细胞中NALP3炎症复合体的基因表达显著增加,H-AASD处理组NALP3炎症复合体的基因表达无显著变化。 结 论 1、北京城市空气颗粒物和亚洲沙尘暴浮尘颗粒物通过增加Th2反应相关的细胞因子和趋化性细胞因子的表达而激活Th2免疫反应,进而加重OVA诱导哮喘小鼠的气道炎症反应;城市空气颗粒物和亚洲沙尘暴浮尘中的二氧化硅成分以及吸附于颗粒物表面的燃料燃烧产物、真菌、细菌可能在上述反应过程中发挥重要作用。 2、亚洲沙尘暴浮尘颗粒物导致小鼠巨噬细胞中TLR2和NALP3炎症复合体基因表达增加。 |